免yi熒光測定，是抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法

一、熒光物質(zhì)

熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免yi熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:

⑴異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，*大吸收光波長為490--495nm，*大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下:

有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用*廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是:①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

⑵四乙基羅丹明(rhodamine，RIB200)為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:

*大吸收光波長為570nm，*大發(fā)射光波長為595~600nm，呈橘紅色熒光。

⑶四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:

*大吸引光波長為550nm，*大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

二、其他熒光物質(zhì)

1)酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基***等。

2)鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3 )、鋱(Tb3 )、鈰(Ce3 )等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用*廣。Eu3

合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，*適合用于分辨熒光免yi測定。